Bir laboratuar ortamında bir protein konsantrasyonu hesaplama en yaygın yöntemlerden biri , bir Bradford Assay kullanmaktır . Reaktif protein konsantrasyonu Bradford göre renk değiştiren bir kolorimetrik reaktiftir. Bradford Reaktif bilinen bir standart eğri birleştirerek , Tamponeşleşen
Sen bilinen bir tampon
Saf antikor ihtiyacınız olacak antibodies.Things dahil olmak üzere herhangi bir proteininkonsantrasyonu hesaplamak hangi karşı bir önlem oluşturabilir kağıt
1ml pipeti
Bradford reaktifi
Laboratuvar kalem
vorteks
Laboratuar ölçekli liyofilize bovin serum albumin ( BSA),
Microcentrifge tüpler
antikorun süspansiyonu > bir Standardı Oluşturmak
Daha Talimatları göster Kalem
Microsoft Excel’in
Labaratuvarı kitabın
Çok iyi plakanın
Kolimetrik plaka okuyucu
1

laboratuar ölçeği kullanarak ağırlık kağıdı üzerinde BSA , 200 mg ölçün. Bir mikrosantrifüj tüp içine alın . BSA, 200 mg ihtiva edenbir mikrosantrifüj tüpüne 2 ml tampon ekleyin. Bu tüp ” 1. ”
2 < p >BSA kadar Vortex Tüpü 1 tamamen çözülür .
3

tampon ve transferiBSA 500 ​​ul kaldır Etiket ikinci bir tüpe . Bu tüp etiketlemek ” 2. ” Tüp düz tampon 500 ul ekleyin 2.
4

Tüp 1 tampon BSA 200 ul çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. Bu tüp etiketlemek ” 3. ” Tüp düz tampon 800 ul ekleyin 3.
5

Tüp 1 tampon BSA 100 ul çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. Bu tüp etiketlemek “4. ” Tüp düz tampon 900 ul ekleyin 4.
6

Tüp 1 tampon BSA 10 ul çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. Bu tüp etiketlemek ” 5. ” Tüp düz tampon 990 ul ekleyin 5. Tüpler 1 5 kademeli bir standart dizi içerir. Birinci tüp , 100 mg /ml ‘lik bir bilinen bir konsantrasyonu vardır; İkinci , 50 mg /ml; Üçüncü olarak, 20 mg /ml , dördüncü , 10 mg /ml; ve beşinci , 1 mg /ml olmuştur. Her bir tüp, çözelti yaklaşık olarak 1 ml içerir.
Oluşturma antikor seyreltileri
7

tampon maddesi 95 0UL üzere saflaştırılmış antikorun 5 0UL ekleyin.
Bu tüp ” A. ” etiketine
8

tamponu 990 ul saflaştırılmış antikor 10 ul ekleyin .
Bu tüp ” B. ” etiketine
9

tamponu 998 ul saflaştırılmış antikorun 2 ul ekleyin. 10 < p >multiwell plaka iki sütundailk kuyularda düz tampon 0.5 ml yerleştirin
plakasını yükleyin bu tüp ” C ”
etiketleyin.

11 < p >multiwell plaka ilk iki sütunikinci kuyularda Tüp 1içeriğinin 0.5 ml yerleştirin . İlk iki sütun düz tampon kuyular dahil , tüpler 1-5 birer BSA standart solüsyonu 0.5 ml içeren kadarkademeli dizi aşağı devam edin .
12

Her Bradford reaktifi 0.5 ml ekleyin iyi . Kuyu herhangi birinin içeriğini dökmek için dikkatli olmak ,proteinli çözeltiler ile reaktif karıştırmak için plaka çalkalanır. 5 dakika daha bekleyin. 13

595 nm bir dalga boyunda plaka okuyucu özelprotokole göreplaka okuyun .
Hesaplayın antikoru Konsantrasyonu

14

Microsoft Excel’eplaka okuyucu okunandeğerleri kopyalayın .
15

Microsoft Excel’deGrafik Sihirbazı kullanarakBSA standardı temsil eden değerleriki sütun bir grafik oluşturun.

16 < p >Excel grafiğindeantikor dilüsyonlardan ölçülennoktaları çizilir . Excel Grafiktekiantikor seyreltme noktası için y – ekseni değerine göre proteinkarşılık gelen konsantrasyonu okuyun .
17

Tüp A, B, elde edilen değerleri kullanarak ister bağlı olarak veya C , sırasıyla , ya 20 , 40 ya da 500 ileçarpın . Elde edilen değer, saflaştırılmış antikorun konsantrasyonudur.