TOPO klonlama , genel olarak , termodinamik olarak stabl olmayan bir 3 ‘A artıkları kullanır ve Taq DNA polimeraz ile birleştirir klonlama bir süreçtir. Buna ek olarak, yöntem 4 ° C olarak muhafaza edilmelidir taze bir polimeraz zincir reaksiyonu ürünü ( PCR ) kullanır. Klonlama Bu tür bir vektörün lineer sonuna eklenen aktif molekülü topoizomeraz optimize eder. TOPO klonlama gerçekleştirmek için, belirli bir protokol takip edilmelidir. Hazırlık

Bazı temel adımlargenel TOPO klonlama işlemini hızlandırmak ve başarısını sağlamak için alınabilir . İlk olarak, yaşayan hücrelerin tüp kabul edilebilirliklerini korumak için buz üzerine yerleştirilmelidir. Daha sonra, süper uygun kültür (ICN) orta besin zenginleştirilmiş bakteri üremesi , oda sıcaklığına getirildi gerekmektedir. Seçici plakalar daha sonra bunları kullanmak için zamanı geldiğinde tamamen hazır böylece 37 santigrat derece önceden ısıtılmış olmalıdır .
Malzemeler
< p >klonlamayı başlamak için birleştiren yöntem , polimeraz zincir reaksiyonu (PCR ) ürün 2 mikro litre , tuz çözeltisi , 0.5 mikrolitre ve klonlama vektörüne 0,5 mikrolitrelik bir kombinasyonu 0.5 mililitrelik bir santrifüj tüpü içinde birleştirilmelidir. Birleştirilen zaman, bu katkı maddeleri oda sıcaklığında ayarlanır ve 5-10 dakika süreyle kuluçkaya bırakıldı gerekir . Daha sonra, bir araya getirilen katkı maddeleri, bir 50 mikrolitrelik bir tüp içinde ” En İyi 10 kimyasal olarak kompetan hücreler ” e eklendi ve on dakika için buz üzerine yerleştirilir. Bundan sonra , hücreler , ısı tam 42 derece Celsius şok olmalıdır ve SOC ortamı içinde 180 mikrolitre ilave edilmeden önce ek bir dakika için buz üzerine yerleştirilmiştir. Sonra, bu karışım 37 ° C’de bir saat daha 200 rpm ‘de bir yatay yönde çalkalanmalıdır.
Son Adımlar

50 mikrolitrelik bir karışımı, ve her bir reaksiyonun 100 mikrolitre ” LB + AMP + X Gal plakalar üzerine ve C. 37 ° C gece boyunca çalkalamadan inkübe ” üzerinden kaplama olmalıdır Ertesi gün , her reaksiyondanüç beyaz koloniler toplanmıştır ve LB + AMP 4 ml içine yerleştirildi ve 200 rpm’de sarsılırken, 37 derece Celsius bir sıcaklıkta gece boyunca inkübasyona bırakılır. Son adımPlazmidlerin mini hazırlanması veişlemin başarılı olup olmadığını görmek için bekliyor .